一种检测BRCA基因突变的PCR反应试剂盒的制作方法

本发明涉及生物工程技术领域，具体为一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒。

背景技术：

brca是具有抑制恶性肿瘤发生的基因，在调节人体细胞的复制、遗传物质dna损伤修复、细胞的正常生长方面有重要作用，已发现的brca的突变有数百种之多，有些与遗传性乳腺癌和卵巢癌有关，总结brca基因突变相关的癌症的终身风险显示，有brca基因突变者患乳腺癌和卵巢癌的风险分别是50％-85％和15％-45％，与普通妇女相比，这些都是很高的患癌几率，由于brca基因的突变对家族性乳腺癌、卵巢癌的发生有一定的联系，所以检测brca的突变基因对相关癌症的诊断、预防和治疗有重要的临床意义，另外，由于brca的突变众多，检测这些突变对于相关基因的研究十分有意义，例如对于基因多态性分析和家族进化史研究，普遍应用的brca基因突变检测方法主要为限制小片段长度多态性分析法(rflp法)和dna直接测序法，rflp法是将pcr与限制性酶切相结合的方法。

目前的检测试剂易被外界细菌感染，非闭管操作，难以避免交叉污染，不能实现通过在检测试剂盒配液中加入抑菌成份，来提高试剂的抗菌效果，无法达到通过在对试剂盒进行灭菌保护的同时，增加抗菌成份提高检测试剂抗菌能力的目的，从而给brca基因突变的检测带来极大的不便。

技术实现要素：

(一)解决的技术问题

针对现有技术的不足，本发明提供了一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，解决了现有的检测试剂易被外界细菌感染，非闭管操作，难以避免交叉污染，不能实现通过在检测试剂盒配液中加入抑菌成份，来提高试剂的抗菌效果，无法达到通过在对试剂盒进行灭菌保护的同时，增加抗菌成份提高检测试剂抗菌能力目的的问题。

(二)技术方案

为实现以上目的，本发明通过以下技术方案予以实现：一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，包括pcr引物和pcr混合液，所述pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液40-50份、三磷酸碱基脱氧核苷酸5-10份、三氯甲烷3-5份、异戊醇3-5份、无水乙醇3-5份、荧光染料3-5份、taqdna聚合酶3-5份、模板dna3-5份。

优选的，所述pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液45份、三磷酸碱基脱氧核苷酸7份、三氯甲烷4份、异戊醇4份、无水乙醇4份、荧光染料4份、taqdna聚合酶4份、模板dna4份。

优选的，所述pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液40份、三磷酸碱基脱氧核苷酸10份、三氯甲烷5份、异戊醇5份、无水乙醇5份、荧光染料5份、taqdna聚合酶5份、模板dna5份。

优选的，所述pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液50份、三磷酸碱基脱氧核苷酸5份、三氯甲烷3份、异戊醇3份、无水乙醇3份、荧光染料3份、taqdna聚合酶3份、模板dna3份。

优选的，所述pcr引物为引物94对(seqidno.195-seqidno.382)。

优选的，所述pcr缓冲液是以ctab和edta-na2·2h2o的组合溶液为基液，再分别添加tris、冰乙酸、硼酸、β-巯基乙醇、琼脂糖、nacl、蔗糖、rnase、ph调节剂和去离子水进行混合配制而成。

优选的，所述荧光染料为溴酚蓝、溴化乙锭eb、二甲苯青ff或溴甲酚绿中的一种。

优选的，检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，其检测方法具体包括以下步骤：

s1、原料的配制：首先通过称量设备分别量取所需重量比份的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料、taqdna聚合酶和模板dna；

s2、pcr引物的选取：然后设计并选取引物94对(seqidno.195-seqidno.382)pcr引物；

s3、pcr混合液的配制：提取模板dna，然后将利用步骤s1量取的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料和taqdna聚合酶依次滴加到电泳槽内，配制成pcr混合液；

s4、pcr扩增：将步骤s2选取的pcr引物滴加到步骤s3配制的pcr混合液中，来对模板dna中brca基因进行pcr扩增；

s5、突变位点检测：对步骤s4获得的扩增产物进行测序和分析，完成全编码区的突变位点检测。

(三)有益效果

本发明提供了一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒。与现有技术相比具备以下有益效果：该检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液40-50份、三磷酸碱基脱氧核苷酸5-10份、三氯甲烷3-5份、异戊醇3-5份、无水乙醇3-5份、荧光染料3-5份、taqdna聚合酶3-5份、模板dna3-5份，可实现通过在检测试剂盒配液中加入抑菌成份，来提高试剂的抗菌效果，很好的达到了通过在对试剂盒进行灭菌保护的同时，增加抗菌成份提高检测试剂抗菌能力的目的，很好的避免了检测试剂被外界细菌感染的情况发生，即使非闭管操作，能避免检测试剂交叉污染，从而保证了brca基因突变检测的准确度。

附图说明

图1为本发明结构示意图。

具体实施方式

下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

请参阅图1，本发明实施例提供三种技术方案：一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，具体包括以下实施例：

实施例1

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，包括pcr引物和pcr混合液，pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液45份、三磷酸碱基脱氧核苷酸7份、三氯甲烷4份、异戊醇4份、无水乙醇4份、荧光染料4份、taqdna聚合酶4份、模板dna4份，pcr引物为引物94对(seqidno.195-seqidno.382)，pcr缓冲液是以ctab和edta-na2·2h2o的组合溶液为基液，再分别添加tris、冰乙酸、硼酸、β-巯基乙醇、琼脂糖、nacl、蔗糖、rnase、ph调节剂和去离子水进行混合配制而成，荧光染料为溴酚蓝。

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，其检测方法具体包括以下步骤：

s1、原料的配制：首先通过称量设备分别量取所需重量比份的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料、taqdna聚合酶和模板dna；

s2、pcr引物的选取：然后设计并选取引物94对(seqidno.195-seqidno.382)pcr引物；

s3、pcr混合液的配制：提取模板dna，然后将利用步骤s1量取的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料和taqdna聚合酶依次滴加到电泳槽内，配制成pcr混合液；

s4、pcr扩增：将步骤s2选取的pcr引物滴加到步骤s3配制的pcr混合液中，来对模板dna中brca基因进行pcr扩增；

s5、突变位点检测：对步骤s4获得的扩增产物进行测序和分析，完成全编码区的突变位点检测。

实施例2

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，包括pcr引物和pcr混合液，pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液40份、三磷酸碱基脱氧核苷酸10份、三氯甲烷5份、异戊醇5份、无水乙醇5份、荧光染料5份、taqdna聚合酶5份、模板dna5份，pcr引物为引物94对(seqidno.195-seqidno.382)，pcr缓冲液是以ctab和edta-na2·2h2o的组合溶液为基液，再分别添加tris、冰乙酸、硼酸、β-巯基乙醇、琼脂糖、nacl、蔗糖、rnase、ph调节剂和去离子水进行混合配制而成，荧光染料为溴化乙锭eb。

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，其检测方法具体包括以下步骤：

s1、原料的配制：首先通过称量设备分别量取所需重量比份的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料、taqdna聚合酶和模板dna；

s2、pcr引物的选取：然后设计并选取引物94对(seqidno.195-seqidno.382)pcr引物；

s3、pcr混合液的配制：提取模板dna，然后将利用步骤s1量取的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料和taqdna聚合酶依次滴加到电泳槽内，配制成pcr混合液；

s4、pcr扩增：将步骤s2选取的pcr引物滴加到步骤s3配制的pcr混合液中，来对模板dna中brca基因进行pcr扩增；

s5、突变位点检测：对步骤s4获得的扩增产物进行测序和分析，完成全编码区的突变位点检测。

实施例3

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，包括pcr引物和pcr混合液，pcr混合液的原料按重量比份包括：pcr缓冲液50份、三磷酸碱基脱氧核苷酸5份、三氯甲烷3份、异戊醇3份、无水乙醇3份、荧光染料3份、taqdna聚合酶3份、模板dna3份，pcr引物为引物94对(seqidno.195-seqidno.382)，pcr缓冲液是以ctab和edta-na2·2h2o的组合溶液为基液，再分别添加tris、冰乙酸、硼酸、β-巯基乙醇、琼脂糖、nacl、蔗糖、rnase、ph调节剂和去离子水进行混合配制而成，荧光染料为溴甲酚绿。

一种检测brca基因突变的pcr反应试剂盒，其检测方法具体包括以下步骤：

s1、原料的配制：首先通过称量设备分别量取所需重量比份的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料、taqdna聚合酶和模板dna；

s2、pcr引物的选取：然后设计并选取引物94对(seqidno.195-seqidno.382)pcr引物；

s3、pcr混合液的配制：提取模板dna，然后将利用步骤s1量取的pcr缓冲液、三磷酸碱基脱氧核苷酸、三氯甲烷、异戊醇、无水乙醇、荧光染料和taqdna聚合酶依次滴加到电泳槽内，配制成pcr混合液；

s4、pcr扩增：将步骤s2选取的pcr引物滴加到步骤s3配制的pcr混合液中，来对模板dna中brca基因进行pcr扩增；

s5、突变位点检测：对步骤s4获得的扩增产物进行测序和分析，完成全编码区的突变位点检测。

综上所述

本发明可实现通过在检测试剂盒配液中加入抑菌成份，来提高试剂的抗菌效果，很好的达到了通过在对试剂盒进行灭菌保护的同时，增加抗菌成份提高检测试剂抗菌能力的目的，很好的避免了检测试剂被外界细菌感染的情况发生，即使非闭管操作，能避免检测试剂交叉污染，从而保证了brca基因突变检测的准确度。

需要说明的是，在本文中，诸如第一和第二等之类的关系术语仅仅用来将一个实体或者操作与另一个实体或操作区分开来，而不一定要求或者暗示这些实体或操作之间存在任何这种实际的关系或者顺序。而且，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。

尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。