酱油及其制备方法与流程

1.本技术涉及食品发酵工程技术领域，特别是涉及一种酱油及其制备方法。


背景技术：

2.酱油是以大豆、小麦等原料经曲霉、酵母、细菌等多种微生物在发酵过程分泌各种酶系综合作用后，再进行压榨、灭菌而来。在酱油酿造过程中，谷氨酸作为呈味主要成分的游离氨基酸，主要有下列三方面来源：
①
原料蛋白质的分解而溶出；
②
微生物谷氨酸生化合成；
③
微生物菌体自溶，其中来源
①
为主要来源，原料谷蛋白经蛋白酶分解为胨、多肽、低肽等物质，再由谷氨酰胺酶作用生成谷氨酸。
3.大豆蛋白含量为35％～40％，其中21％为谷蛋白，小麦蛋白含量为10％～15％，谷蛋白占比30％，因此，从原料计算单位全氮谷氨酸得率约为1.35～1.46。在《酱油科学与酿造技术》中介绍了米曲霉的大曲发酵的原油单位全氮谷氨酸得率在0.80。现有市面上标识黄豆或脱脂大豆、小麦或麸皮，零添加系列酱油单位全氮谷氨酸得率在0.50～0.90。因此，传统酱油制备方法存在着原料谷蛋白利用率低的问题，急需通过工艺技术创新，减少发酵过程原料鲜味物质损失，提高酱油单位全氮谷氨酸得率，提升酿造酱油风味。
4.而目前对于传统酱油制备方法的改进，主要是对于综合酶活力带来的谷氨酸提高的研究，存在着酶活力作用低效，生产成本高，不利于工业化推广等问题。


技术实现要素：

5.基于此，有必要提供一种酱油及其制备方法，以提高酱油单位全氮谷氨酸得率，提升酿造酱油风味。
6.本技术一方面提供了一种酱油的制备方法，包括如下步骤：
7.提供制备酱油的原料；
8.向原料中加入曲霉菌进行制曲，并在制曲过程中加入纤维素酶，得到成曲；
9.向所述成曲中加入食盐水进行制醪，得到酱醪并对所述酱醪进行发酵；
10.所述酱醪发酵至ph达到6.30～6.50时，向其中加入中性蛋白酶和淀粉酶并继续发酵；
11.所述酱醪发酵至ph达到5.10～5.50时，向其中加入谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶并继续发酵；
12.所述酱醪发酵至ph达到4.90～5.20时，再次向其中加入谷氨酰胺酶并继续发酵，得到成醪；
13.将所述成醪进行固液分离，得到酱油。
14.在其中一些实施例中，所述原料包括大豆、小麦、麸皮、花生、蚕豆、豌豆、玉米、大米以及小米中的一种或多种。
15.在其中一些实施例中，所述曲霉菌包括米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉中的一种或多种。
16.在其中一些实施例中，所述在制曲过程中加入纤维素酶的步骤中，所述纤维素酶在制曲24h～30h时加入。
17.在其中一些实施例中，所述纤维素酶的加入量为制备酱油的原料重量的0.01
‰
～0.12
‰
。
18.在其中一些实施例中，所述食盐水的加入量为成曲重量的1.5倍～2.0倍，所述食盐水的质量百分浓度为18％～25％。
19.在其中一些实施例中，步骤(d)满足如下条件中的至少一个：
20.(1)中性蛋白酶的加入量为所述酱醪重量的0.03
‰
～0.18
‰
，
21.(2)淀粉酶的加入量为所述酱醪重量的0.01
‰
～0.12
‰
。
22.在其中一些实施例中，步骤(e)满足如下条件中的至少一个：
23.(1)酸性蛋白酶的加入量为所述酱醪重量的0.04
‰
～0.25
‰
，
24.(2)谷氨酰胺酶的加入量为所述酱醪重量的0.06
‰
～0.30
‰
。
25.在其中一些实施例中，步骤(f)中，谷氨酰胺酶的加入量为所述酱醪重量的0.01
‰
～0.15
‰
。
26.本技术另一方面，还提供一种由所述的酱油的制备方法制备得到的酱油。
27.本技术提供的酱油的制备方法，根据不同的酶制剂特性和酿造酱油发酵过程的物质变化特点，在制曲环节和发酵环节有目的添加不同的酶制剂增强发酵过程酶活力，实现酶制剂高效作用，从而提高单位全氮谷氨酸得率，提升酱油风味。
附图说明
28.图1为一实施方式提供的酱油制备方法的流程示意图。
具体实施方式
29.为了便于理解本技术，下面将参照相关附图对本技术进行更全面的描述。附图中给出了本技术的较佳实施例。但是，本技术可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本技术的公开内容的理解更加透彻全面。
30.除非另有定义，本文所使用的所有的技术和科学术语与属于本技术的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本文中在本技术的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不是旨在于限制本技术。
31.本文中，以开放式描述的技术特征中，包括所列举特征组成的封闭式技术方案，也包括包含所列举特征的开放式技术方案。
32.本文中，涉及到数值区间，如无特别说明，上述数值区间内视为连续，且包括该范围的最小值及最大值，以及这种最小值与最大值之间的每一个值。进一步地，当范围是指整数时，包括该范围的最小值与最大值之间的每一个整数。此外，当提供多个范围描述特征或特性时，可以合并该范围。换言之，除非另有指明，否则本文中所公开之所有范围应理解为包括其中所归入的任何及所有的子范围。
33.在本文中，涉及数据范围的单位，如果仅在右端点后带有单位，则表示左端点和右端点的单位是相同的。比如，0.3～0.5m/s表示左端点“0.3”和右端点“0.5”的单位都是m/s
(米/秒)。
34.本文仅具体地公开了一些数值范围。然而，任意下限可以与任意上限组合形成未明确记载的范围；以及任意下限可以与其它下限组合形成未明确记载的范围，同样任意上限可以与任意其它上限组合形成未明确记载的范围。此外，每个单独公开的点或单个数值自身可以作为下限或上限与任意其它点或单个数值组合或与其它下限或上限组合形成未明确记载的范围。
35.如果没有特别的说明，本技术的所有步骤可以顺序进行，也可以随机进行。例如，所述方法包括步骤(a)和(b)，表示所述方法可包括顺序进行的步骤(a)和(b)，也可以包括顺序进行的步骤(b)和(a)。例如，所述提到所述方法还可包括步骤(c)，表示步骤(c)可以任意顺序加入到所述方法，例如，所述方法可以包括步骤(a)、(b)和(c)，也可包括步骤(a)、(c)和(b)，也可以包括步骤(c)、(a)和(b)等。
36.酱油等液体调味料是人们生活中不可或缺的调味品之一，因其味道鲜美、营养丰富，而受到广大消费者的喜爱。然而传统酱油制备方法在发酵过程中原料鲜味物质易损失，酱油单位全氮谷氨酸得率低，影响了酱油风味。本技术技术人员经研究发现，提高发酵过程酶活力可以带来单位全氮谷氨酸得率的提升。
37.相关技术中，大多通过混合酶制剂来提高发酵过程酶活力，但对酶活力的提升作用仍非常低效。
38.为了解决上述问题，本技术提供了一种酱油的制备方法，请参阅图1，包括以下步骤：
39.(a)提供制备酱油的原料；
40.(b)向原料中加入曲霉菌进行制曲，并在制曲过程中加入纤维素酶，得到成曲；
41.(c)向成曲中加入食盐水进行制醪，得到酱醪并对所述酱醪进行发酵；
42.(d)酱醪发酵至ph达到6.30～6.50时，向其中加入中性蛋白酶和淀粉酶并继续发酵；
43.(e)酱醪发酵至ph达到5.10～5.50时，向其中加入谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶并继续发酵；
44.(f)酱醪发酵至ph达到4.90～5.20时，再次向其中加入谷氨酰胺酶并继续发酵，得到成醪；
45.(g)将成醪进行固液分离，得到酱油。
46.本技术实施例提供的酱油的制备方法，通过在制曲阶段添加纤维素酶增强酶系对原料细胞壁的破壁效果，为蛋白酶等酶系创造作用条件；开始发酵时添加中性蛋白酶和淀粉酶增强大分子蛋白物质分解效果，提升谷氨酸的前体物质含量；发酵一定时间后添加谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶，提高发酵过程谷氨酸的生成量；发酵到一定的条件后，二次添加谷氨酰胺酶，保持发酵过程有充足的谷氨酰胺酶，避免谷氨酸形成无味的焦谷氨酸，从而有效提高酱油单位全氮谷氨酸得率，提升酿造酱油风味。
47.制备酱油的原料可以包括但不限于，大豆、小麦、麸皮、花生、蚕豆、豌豆、玉米、大米、小米以及它们的组合。可理解地，制备酱油的原料中各成分比例可以参照本领域常规配比。例如，在一些实施方式中，制备酱油的原料为大豆和小麦，其中，大豆和小麦的比例可以为(5-8):(2-5)，例如5:5、6:4、7:3、8:2。
48.进一步地，步骤(a)还可以包括对制备酱油的原料进行预处理的步骤。预处理步骤可以为本领域技术人员习知的常规方法，例如筛选、除杂、清洗、润水、干燥、热处理、破碎或研磨等。其中，热处理可以包括湿热处理、热风处理(干热处理)、喷雾干燥处理、过热蒸汽处理(常压蒸汽处理和高压蒸汽处理)、挤压处理、微波处理和红外热处理等。具体的热处理操作例如蒸煮、焙炒等。可理解地，预处理步骤可以根据原料的特性进行合适的选择，通常按照本领域常规操作进行。例如，对大豆进行预处理的操作可以包括筛选、除杂、清洗、润水、蒸煮和破碎，对小麦进行预处理的操作可以包括筛选、除杂、清洗、干燥、焙炒和研磨。
49.用于制曲的曲霉菌可以包括米曲霉、黑曲霉和酱油曲霉中的一种或多种。在一些实施方式中，曲霉菌为米曲霉。在另一些实施方式中，曲霉菌为米曲霉和黑曲霉。在又一些实施方式中，曲霉菌还可以为米曲霉和酱油曲霉。可理解地，曲霉菌的加入量可参照本领域常规用量，例如，通常曲霉菌按原料重量接入0.1％(m/m)～0.2％(m/m)曲霉菌种。可理解地，曲霉菌若包含有两种及以上的菌种，其比例可以参照本领域常规配比。
50.在一些实施方式中，步骤(b)中，在制曲过程中加入纤维素酶的步骤中，纤维素酶在制曲24h～30h时加入，更有利于纤维素酶对原料细胞壁的破壁作用。可理解地，纤维素酶可以在制曲24h、25h、26h、27h、28h、29h或30h任意时间加入曲料。
51.在一些实施方式中，纤维素酶的加入量为制备酱油的原料重量的0.01
‰
～0.12
‰
。可理解地，纤维素酶的加入量可以为制备酱油的原料重量的0.01
‰
～0.12
‰
之间的任意值，例如，还包括0.02
‰
、0.03
‰
、0.04
‰
、0.05
‰
、0.06
‰
、0.07
‰
、0.08
‰
、0.09
‰
、0.10
‰
、0.11
‰
。
52.可理解地，纤维素酶的加入方式可以为任意本领域常规方法，通常选择便于后续步骤的操作以及更有利于本技术的方法。例如，可以将纤维素酶溶于水中制成溶液以便于添加，同时制成溶液可以方便的借助工具均匀喷洒至原料，有利于纤维素酶均匀有效的作用于原料。
53.在一些实施方式中，将纤维素酶溶解在水(25℃～35℃)中制成纤维素酶液。步骤(b)中，在制曲过程中纤维素酶以纤维素酶液的方式加入原料中。进一步地，纤维素酶液均匀喷洒至原料表面。进一步地，纤维素酶液中纤维素酶的质量百分浓度为1
‰
～4
‰
。更进一步地，纤维素酶液的加入量为制备酱油的原料重量的1％～3％。
54.在一些实施方式中，食盐水的加入量为成曲重量的1.5倍～2.0倍，食盐水的质量百分浓度为18％～25％。可理解地，食盐水的加入量可以为成曲重量的1.5倍～2.0倍之间的任意值，例如还包括1.6倍、1.7倍、1.8倍、1.9倍。食盐水的质量百分浓度可以为18％～25％之间的任意值，例如还包括19％、20％、21％、22％、23％、24％。
55.可理解地，酱醪发酵至ph达到6.30～6.50是指酱醪ph在6.30～6.50之间的任意值，例如还包括6.35、6.4、6.45。
56.在一些实施方式中，中性蛋白酶的加入量为酱醪重量的0.03
‰
～0.18
‰
。可理解地，中性蛋白酶的加入量可以为酱醪重量的0.03
‰
～0.18
‰
之间的任意值，例如还包括0.05
‰
、0.06
‰
、0.07
‰
、0.08
‰
、0.09
‰
、0.10
‰
、0.12
‰
、0.14
‰
、0.16
‰
。
57.在一些实施方式中，淀粉酶的加入量为所述酱醪重量的0.01
‰
～0.12
‰
。可理解地，淀粉酶的加入量可以为酱醪重量的0.01
‰
～0.12
‰
之间的任意值，例如还包括0.02
‰
、0.03
‰
、0.04
‰
、0.05
‰
、0.06
‰
、0.07
‰
、0.08
‰
、0.09
‰
、0.10
‰
、0.11
‰
。
58.可理解地，中性蛋白酶和淀粉酶的加入方式可以为任意本领域常规方法，通常选择便于后续步骤的操作以及更有利于本技术的方法。例如，可以将中性蛋白酶和淀粉酶溶于水中制成溶液以便于添加，同时制成溶液可以方便的借助工具均匀喷洒至酱醪，有利于中性蛋白酶和淀粉酶均匀有效的作用于酱醪。
59.在一些实施方式中，将中性蛋白酶和淀粉酶溶解在水(25℃～35℃)中制成中性蛋白酶和淀粉酶的混合酶液。步骤(d)中，中性蛋白酶和淀粉酶以中性蛋白酶和淀粉酶的混合酶液的方式加入原料中。进一步地，中性蛋白酶和淀粉酶的混合酶液均匀喷洒至酱醪表面。进一步地，中性蛋白酶和淀粉酶的混合酶液中中性蛋白酶的质量百分浓度为3％～6％，淀粉酶的质量百分浓度为1％～4％。更进一步地，中性蛋白酶和淀粉酶的混合酶液的加入量为酱醪重量的1
‰
～3
‰
。
60.可理解地，酱醪发酵至ph达到5.10～5.50是指酱醪ph在5.10～5.50之间的任意值，例如还包括5.20、5.30、5.40。
61.在一些实施方式中，酸性蛋白酶的加入量为酱醪重量的0.04
‰
～0.25
‰
。可理解地，酸性蛋白酶的加入量可以为酱醪重量的0.04
‰
～0.25
‰
之间的任意值，例如还包括0.05
‰
、0.06
‰
、0.07
‰
、0.08
‰
、0.09
‰
、0.10
‰
、0.12
‰
、0.14
‰
、0.16
‰
、0.18
‰
。
62.在一些实施方式中，步骤(e)中谷氨酰胺酶的加入量为酱醪重量的0.06
‰
～0.30
‰
。可理解地，谷氨酰胺酶的加入量可以为酱醪重量的0.06
‰
～0.30
‰
之间的任意值，例如还包括0.07
‰
、0.08
‰
、0.09
‰
、0.10
‰
、0.12
‰
、0.14
‰
、0.16
‰
、0.18
‰
、0.20
‰
、0.22
‰
、0.24
‰
、0.26
‰
、0.28
‰
。
63.可理解地，步骤(e)中谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的加入方式可以为任意本领域常规方法，通常选择便于后续步骤的操作以及更有利于本技术的方法。例如，可以将谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶溶于水中制成溶液以便于添加，同时制成溶液可以方便的借助工具均匀喷洒至酱醪，有利于谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶均匀有效的作用于酱醪。
64.在一些实施方式中，将谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶溶解在水(25℃～35℃)中制成谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的混合酶液。步骤(e)中，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶以谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的混合酶液的方式加入原料中。进一步地，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的混合酶液均匀喷洒至酱醪表面。进一步地，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的混合酶液中谷氨酰胺酶的质量百分浓度为3％～6％，酸性蛋白酶的质量百分浓度为2％～5％。更进一步地，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的混合酶液的加入量为酱醪重量的2
‰
～5
‰
。
65.在一些实施方式中，步骤(f)中谷氨酰胺酶的加入量为酱醪重量的0.01
‰
～0.15
‰
。可理解地，谷氨酰胺酶的加入量可以为酱醪重量的0.01
‰
～0.15
‰
之间的任意值，例如还包括0.02
‰
、0.04
‰
、0.06
‰
、0.08
‰
、0.10
‰
、0.12
‰
、0.14
‰
。
66.可理解地，步骤(f)中谷氨酰胺酶的加入方式可以为任意本领域常规方法，通常选择便于后续步骤的操作以及更有利于本技术的方法。例如，可以将谷氨酰胺酶溶于水中制成溶液以便于添加，同时制成溶液可以方便的借助工具均匀喷洒至酱醪，有利于谷氨酰胺酶均匀有效的作用于酱醪。
67.在一些实施方式中，将谷氨酰胺酶溶解在水(25℃～35℃)中制成谷氨酰胺酶液。步骤(f)中，谷氨酰胺酶以谷氨酰胺酶液的方式加入原料中。进一步地，谷氨酰胺酶液均匀喷洒至酱醪表面。进一步地，谷氨酰胺酶酶液中谷氨酰胺酶的质量百分浓度为0.5％～3％。
更进一步地，谷氨酰胺酶液的加入量为酱醪重量的2
‰
～5
‰
。
68.可理解地，将成醪固液分离的方法可以按照本领域常规操作进行，例如通过板框分离酱油和酱醅。
69.还一方面，本技术进一步提供上述任一实施方式的制备方法制得的酱油。
70.以下为具体实施例。旨在对本技术做进一步的详细说明，以帮助本领域技术及研究人员进一步理解本技术，有关技术条件等并不构成对本技术的任何限制。在本技术权利要求范围内所做的任何形式的修改，均在本技术权利要求的保护范围之内。实施例中采用药物和仪器如非特别说明，均为本领域常规选择。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
71.除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。实施例中未注明具体条件的实验方法，按照常规条件，例如文献、书本中所述的条件或者生产厂家推荐的方法实现。
72.需要说明的是，下文中“润水”是指给原料加入适当的水分，并使原料均匀吸收水分。“润水比例”是指大豆的重量和润水操作时用水重量的百分比。
73.实施例1
74.1、大豆预处理：大豆筛选、除杂、润水(润水比例125％)，完成润水后进行蒸煮，蒸煮条件为120℃，0.18mpa，蒸煮时间为90s。
75.2、小麦预处理：小麦筛选、除杂后对小麦进行焙炒，焙炒温度250℃，时间2min，焙炒后降温至40℃后进行磨粉。
76.3、制曲：将步骤1～2预处理好的大豆和小麦粉混合均匀，得到原料，并按原料重量添加0.1％(m/m)米曲霉后进行拌匀制曲。
77.4、酶液a制备：将纤维素酶溶解至30℃自来水中得到酶液a，其中纤维素酶的质量百分浓度为3
‰
。
78.5、酶液a添加：将步骤4所得酶液a在步骤3制曲25h后通过喷洒添加到曲料，添加比例为原料重量的2％，继续培养20h，得到成熟的曲料。
79.6、制醪：将步骤5得到的曲料按照重量加入2.0倍的食盐水，进行制醪。所用食盐水浓度为20％，酱醪ph值为6.45。
80.7、酶液b制备：将中性蛋白酶、淀粉酶溶解至30℃自来水得到酶液b，其中，中性蛋白酶和淀粉酶的质量百分浓度分别为4％和2％。
81.8、酶液b添加：将步骤7所得酶液b添加至步骤6制得的酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的2
‰
，搅拌45min后进行酱醪发酵。
82.9、酶液c制备：将谷氨酰胺酶、酸性蛋白酶溶解30℃自来水得到酶液c，其中，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的质量百分浓度分别为4％和3％。
83.10、酶液c添加：完成步骤8后，发酵至8d，酱醪ph值为5.40，将步骤9所得酶液c加至酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的3
‰
，搅拌45min后继续发酵。
84.11、酶液d制备：将谷氨酰胺酶溶解至30℃自来水得到酶液d，其中，谷氨酰胺酶的质量百分浓度为2％。
85.12、酶液d添加：完成步骤10后继续发酵至40d，酱醪ph值为4.95，将步骤11所得酶液d添加至酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的3
‰
，搅拌45min后继续发酵，发酵
65d得到成熟酱醪。
86.13、压榨：将步骤12发酵成熟的酱醪通过板框分离酱油和酱醅。
87.实施例2
88.与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
89.酶液a添加比例为原料重量的1.5％；
90.酶液b添加比例为酱醪重量的1.5
‰
；
91.酶液c添加比例为酱醪重量的2.5
‰
；
92.酶液d添加比例为酱醪重量的1
‰
。
93.实施例3
94.与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
95.酶液a添加比例为原料重量的3％；
96.酶液b添加比例为酱醪重量的3
‰
；
97.酶液c添加比例为酱醪重量的5
‰
；
98.酶液d添加比例为酱醪重量的3
‰
。
99.实施例4
100.与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于：
101.酶液a添加比例为原料重量的4％；
102.酶液b添加比例为酱醪重量的4
‰
；
103.酶液c添加比例为酱醪重量的6
‰
；
104.酶液d添加比例为酱醪重量的4
‰
。
105.对比例1
106.1、大豆预处理：大豆筛选、除杂、润水(润水比例125％)，完成润水后进行蒸煮，蒸煮条件为120℃，0.18mpa，蒸煮时间为90s。
107.2、小麦预处理：小麦筛选、除杂后对小麦进行焙炒，焙炒温度250℃，时间2min，焙炒后降温至40℃后进行磨粉。
108.3、制曲：将步骤1～2预处理好的大豆和小麦粉混合均匀，得到原料，并按原料重量添加0.1％(m/m)米曲霉后进行拌匀制曲。
109.4、制醪：将步骤3得到的曲料按照重量加入2.0倍的食盐水，进行制醪，制醪所用食盐水浓度为20％，酱醪ph值为6.88。
110.5、发酵：步骤4制醪得到的酱醪每隔10d搅拌45min，发酵65d得到成熟的酱醪。
111.6、压榨：将步骤5发酵成熟的酱醪通过板框分离酱油和酱醅。
112.对比例2
113.1、大豆预处理：大豆筛选、除杂、润水(润水比例125％)，完成润水后进行蒸煮，蒸煮条件为120℃，0.18mpa，蒸煮时间为90s。
114.2、小麦预处理：小麦筛选、除杂后对小麦进行焙炒，焙炒温度250℃，时间2min，焙炒后降温至40℃后进行磨粉。
115.3、制曲：将步骤1～2预处理好的大豆和小麦粉混合均匀，得到原料，并按原料重量添加0.1％(m/m)米曲霉后进行拌匀制曲。
116.4、制醪：将步骤3得到的曲料按照重量加入2.0倍的食盐水，进行制醪。所用食盐水
浓度为20％，酱醪ph值为6.45。
117.5、酶液a制备：将纤维素酶溶解至30℃自来水中得到酶液a，其中纤维素酶的质量百分浓度为3
‰
。
118.酶液b制备：将中性蛋白酶、淀粉酶溶解至30℃自来水得到酶液b，其中，中性蛋白酶和淀粉酶的质量百分浓度分别为4％和2％。
119.酶液c制备：将谷氨酰胺酶、酸性蛋白酶溶解30℃自来水得到酶液c，其中，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的质量百分浓度分别为4％和3％。
120.酶液d制备：将谷氨酰胺酶溶解至30℃自来水得到酶液d，其中，谷氨酰胺酶的质量百分浓度为2％。
121.6、酶液添加发酵：将步骤5制备的酶液a～d同时添加至步骤4得到的酱醪中，酶液a添加比例为原料重量的2％；酶液b添加比例为步骤4制醪所得酱醪重量的2
‰
；酶液c添加比例为步骤4制醪所得酱醪重量的3
‰
；酶液d添加比例为步骤4制醪所得酱醪重量的3
‰
,搅拌45min后酱醪继续发酵,发酵65d得到成熟酱醪。
122.7、压榨：将步骤6发酵成熟的酱醪通过板框分离酱油和酱醅。
123.对比例3
124.1、大豆预处理：大豆筛选、除杂、润水(润水比例125％)，完成润水后进行蒸煮，蒸煮条件为120℃，0.18mpa，蒸煮时间为90s。
125.2、小麦预处理：小麦筛选、除杂后对小麦进行焙炒，焙炒温度250℃，时间2min，焙炒后降温至40℃后进行磨粉。
126.3、制曲：将步骤1～2预处理好的大豆和小麦粉混合均匀，得到原料，并按原料重量添加0.1％(m/m)米曲霉后进行拌匀制曲。
127.4、酶液d制备：将谷氨酰胺酶溶解至30℃自来水得到酶液d，其中，谷氨酰胺酶的质量百分浓度为2％。
128.5、酶液d添加：将步骤4所得酶液d在步骤3制曲25h后通过喷洒添加到曲料，添加比例为原料重量的2％，继续培养20h，得到成熟的曲料。
129.6、制醪：将步骤5得到的曲料按照重量加入2.0倍的食盐水，进行制醪。所用食盐水浓度为20％，酱醪ph值为6.45。
130.7、酶液b制备：将中性蛋白酶、淀粉酶溶解至30℃自来水得到酶液b，其中，中性蛋白酶和淀粉酶的质量百分浓度分别为4％和2％。
131.8、酶液b添加：将步骤7所得酶液b添加至步骤6制得的酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的2
‰
，搅拌45min后进行酱醪发酵。
132.9、酶液c制备：将谷氨酰胺酶、酸性蛋白酶溶解30℃自来水得到酶液c，其中，谷氨酰胺酶和酸性蛋白酶的质量百分浓度分别为4％和3％。
133.10、酶液c添加：完成步骤8后，发酵至8d，酱醪ph值为5.40，将步骤9所得酶液c加至酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的3
‰
，搅拌45min后继续发酵。
134.11、酶液a制备：将纤维素酶溶解至30℃自来水中得到酶液a，其中纤维素酶的质量百分浓度为3
‰
。
135.12、酶液a添加：完成步骤10后继续发酵至40d，酱醪ph值为4.95，将步骤11所得酶液a添加至酱醪中，添加比例为步骤6制醪所得酱醪重量的3
‰
，搅拌45min后继续发酵，发酵
65d得到成熟酱醪。
136.13、压榨：将步骤12发酵成熟的酱醪通过板框分离酱油和酱醅。
137.对比例4
138.与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，省略步骤4和步骤5，即不添加酶液a，直接再将步骤3得到的曲料按照重量加入2.0倍的食盐水，进行制醪。
139.对比例5
140.与实施例1的制备方法基本相同，不同之处在于，省略步骤11和步骤12，即不添加酶液d，直接将步骤10的酱醪发酵至65d得到成熟酱醪，再通过板框分离酱油和酱醅。
141.将实施例1～4和对比例1～5制备的酱油进行检测，检测项目以及检测方法和标准如下：
142.1、单位全氮谷氨酸得率：单位全氮谷氨酸得率＝原油谷氨酸/原油全氮，其中原油全氮依据gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的检测》第一法凯氏定氮法；原油谷氨酸依据谷氨酸检测试剂盒检测。
143.2、渣残留蛋白：渣残留蛋白依据gb 5009.5-2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的检测》第一法凯氏定氮法。
144.将实施例1～4和对比例1～5制备酱油的条件和检测结果列于表1如下：
145.表1
146.项目酶液添加顺序酶液a/b/c/d添加比例单位全氮谷氨酸得率渣残留蛋白(％)实施例1a-b-c-d2％/2
‰
/3
‰
/3
‰
1.104.5实施例2a-b-c-d1.5％/1.5
‰
/2.5
‰
/1
‰
1.004.8实施例3a-b-c-d3％/3
‰
/5
‰
/3
‰
1.184.0实施例4a-b-c-d4％/4
‰
/6
‰
/4
‰
1.193.9对比例1无添加/0.617.0对比例2酶液混合添加2％/2
‰
/3
‰
/3
‰
0.656.7对比例3d-b-c-a2％/2
‰
/3
‰
/3
‰
0.686.8对比例4b-c-d0％/2
‰
/3
‰
/3
‰
0.727.0对比例5a-b-c2％/2
‰
/3
‰
/0
‰
0.836.0
147.从表1可以看出，本技术实施例1～4中单位全氮谷氨酸得率均明显优于对比例1～5。
148.对比实施例1和对比例2，酶液添加量一致，实施例1的单位全氮谷氨酸得率显著高于对比例2，对比实施例1和对比例3，实施例1的单位全氮谷氨酸得率显著高于对比例3，说明制曲发酵过程中不同阶段需要增强的酶系活力是有针对性的。
149.对比实施例1和对比例4～5，实施例1的单位全氮谷氨酸得率也显著高于对比例4～5，虽然对比例4～5的单位全氮谷氨酸得率相对于对比例有所提升，但相对于实施例1仍较低，说明缺少其中任一种酶的加强作用，均会对酶活力产生影响。
150.综上，说明本技术提供的酱油的制备方法可高效、经济地酿造酱油，实现单位全氮谷氨酸得率显著提升。
151.以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合，为使描述简洁，未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述，然而，只要这些技术特征的组合不存在矛盾，都应当认为是本说明书记载的范围。
152.以上所述实施例仅表达了本技术的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本技术构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本技术的保护范围。因此，本技术专利的保护范围应以所附权利要求为准。