由于农业和工矿业生产等人类活动的影响, 环境中的镉(Cd)污染问题日益严重, 2014年的全国土壤污染状况调查公报显示, 不同土地利用类型的土壤均有不同程度的Cd污染, 其中Cd点位超标率为7.0%^{[ 1]}. Cd是我国污染土壤中常见的重金属元素之一, 具有分解周期长、移动性大和难降解等特点, 会对植株产生毒害作用^{[ 2]}. Cd胁迫会改变细胞质膜的通透性, 影响矿质元素的吸收, 导致植株体内矿质元素含量和成分改变, 致使植物矿质营养缺乏, 引起代谢活动和物质合成过程紊乱, 从而影响植物的生长和发育^{[ 3]}.水稻能够吸收污染土壤中的Cd并将其积累在籽粒中, 我国食品卫生标准中稻谷、糙米和大米中Cd的限量标准为0.2 mg·kg^{-1[ 4]}.水稻中的Cd可通过食物链进入人体, 在人体内代谢缓慢, 对人体的健康和生命安全造成严重危害^{[ 5]}.因此, 为降低重金属污染农田中水稻可食用部位的Cd含量, 保证粮食安全生产, 研发探索一套环境友好和安全有效的水稻Cd污染防治技术尤为重要.

现有的水稻Cd污染治理技术主要集中在添加土壤钝化剂和施加叶面阻控剂等方面^{[ 6, 7]}, 其中土壤钝化剂处理总体上能够降低稻米对Cd的吸收, 但土壤钝化剂修复效果不稳定, 且自身有毒或有一定副作用, 长期使用会提高土壤pH值, 造成土壤板结, 破坏土壤结构等^{[ 8]}, 这些都造成了土壤钝化剂在使用中的局限性.而近年来, 叶面阻隔技术在重金属污染防治方面成为研究热点.在水稻特定生长时期叶面喷施调理剂, 能够通过调控重金属Cd在水稻内的转运, 抑制Cd向水稻可食用部位转运, 从而降低农产品中Cd含量^{[ 9]}.该方法成本低、环境友好、无二次污染、甚至能够高效增产, 有大面积应用于中轻度重金属污染农田的潜力^{[ 10]}.有研究表明, 叶面喷施低浓度S-烯丙基-L-半胱氨酸可降低水稻籽粒中Pb含量^{[ 11]}.叶面施加硅^{[ 12]}和锌^{[ 13]}可显著抑制Cd向稻米的转运.叶面喷施苹果酸^{[ 14]}可显著降低稻米中的Cd含量.杨晓荣等^{[ 7]}的研究证实叶面喷施二巯基丁二酸可通过与水稻叶片中的Cd²⁺形成螯合物显著降低籽粒Cd含量.

L-Cys(L-半胱氨酸, L-cysteine)是一种生物体内常见的含硫α-氨基酸, L-Cys中的活性巯基(—SH)基团具有还原性和化学反应活性, 在蛋白质和细胞膜的生物合成中发挥关键作用, 能够保护细胞免受氧化损伤, 在生物体中起着多种重要作用^{[ 15]}.L-Cys是合成自由基清除剂GHS的重要前体, 其结构中的巯基作为重要活性官能团, 能够与金属离子形成不溶性的硫醇盐, 在抗氧化、排除体内毒素、构建和维持细胞膜和髓鞘等方面发挥关键作用, 而L-Cys水平太低则会损害生物体的免疫系统^{[ 16, 17]}.富含L-Cys的转运蛋白, 如金属硫蛋白是生物体内最广泛的Cd转运蛋白, 而植物螯合肽在水稻中也起到运输和储存Cd的作用^{[ 18]}.有研究表明, L-Cys是水稻叶片中的一种重要巯基化合物, 在Cd胁迫下其含量下降^{[ 19]}.植株体内半胱氨酸含量显著增加是导致水稻突变体cadt1耐Cd性增强的主要原因之一^{[ 20]}.由于L-Cys有助于缓解植物对重金属诱导的氧化应激^{[ 21]}, 近年来利用L-Cys应对重金属胁迫逐渐成为焦点.有研究表明, 喷施1.0~2.5 mmol·L^-1的外源L-Cys可提高小麦幼苗对铜胁迫的耐受性^{[ 22]}.与L-Cys合成相关的酶参与了稻米中的Cd解毒^{[ 23]}. Cd与L-Cys形成的复合物可能参与了Cd在哺乳动物中的转运^{[ 24]}.由此可见, L-Cys参与包括Cd在内的重金属转运, 并且在缓解重金属毒性方面发挥重要作用.然而, 叶面喷施L-Cys对Cd污染水稻的作用及其机制研究还鲜见报道.本文通过田间试验, 在Cd污染农田水稻开花期叶面喷施不同浓度的L-Cys, 研究其对水稻籽粒中Cd和矿质营养元素含量的影响, 并通过分离水稻各部位营养器官并检测其Cd分布和Cd赋存形态的方法, 探索叶面喷施L-Cys对水稻Cd积累和转运的调控机制, 以期为其作为水稻降Cd叶面调理剂的应用提供数据支持和理论依据.

湖南省湘潭市是重要的矿冶和重工业基地, 早期工业污染严重, 同时我国南方降雨频繁且水网复杂, 造成农田Cd污染直接影响水稻安全生产^{[ 25]}.本试验地点位于湖南省湘潭市(27°52′N, 112°51′E), 试验田土壤类型为水稻土, 耕层土壤pH 5.6, 有机质含量69.9 g·kg^-1, 阳离子交换量9.5 cmol·kg^-1, Cd含量0.6 mg·kg^-1.本试验水稻品种为当地主栽品种华占, 种子购于当地种子公司.L-Cys购于上海麦克林生化科技有限公司, 纯度99%.

称取适量的L-Cys溶于田间灌溉水, 并加水稀释至1.0 L, 配制成0.5、5和10 mmol·L^-1L-Cys水溶液, 作为处理组, 本试验共设置1个空白对照喷施组CK, 3个处理组, 每组设4次重复.田间试验小区面积设定为5 m²(2 m×2.5 m).水稻于2019年6月育秧, 7月下旬移栽至稻田, 9月下旬(开花期)在叶面均匀喷施不同浓度L-Cys.整个生育期无显著病虫害发生.

于水稻成熟期, 选取小区中心处喷施较为均匀部分, 用铁锹每小区随机连根挖取4株水稻植株, 装入网袋.常温自然风干后, 将水稻植株分为籽粒、穗轴、穗颈(第一节间)、旗叶、第一节(穗下节)、第二节、第二叶、第二节间、基部茎叶和根共10个部分(如 图 1).去离子水冲洗3次, 于70℃下烘干72 h, 冷却至室温.籽粒用砻谷机脱壳后磨成粉末, 其余部位剪刀剪碎后用万能粉碎机磨粉, 分别收集备用.

图 1

Fig. 1

图 1 水稻各营养器官示意 Fig. 1 Structure diagram of different vegetative organs of rice

分别称取0.5 g籽粒粉末或0.25 g营养器官粉末于聚四氟乙烯消解管中, 加入7 mL浓硝酸, 摇匀, 室温下静置过夜.于电热消解仪(Digi Block ED54)上进行消解, 110℃加热2.5 h后冷却至室温, 加入1 mL H₂O₂摇匀, 110℃继续加热1.5 h, 最后于170℃下赶酸至0.5 mL以内, 用去离子水稀释并转移至25 mL容量瓶内过滤定容, 用电感耦合等离子体质谱仪(ICP-MS, Agilent 7500a, USA)测定样品中Cd、Mg、K、Ca、Mn和Zn含量.在本研究中, 籽粒中Cd及营养元素测定的标准样品为TMQC0009(BBS- 1大米), Cd、Mg、K、Ca、Mn和Zn的回收率分别为101.85%、95.49%、97.75%、100.22%、100.86%和97.78%.其它营养器官中Cd含量测定的标准样品为GBW10020(GSB- 11柑橘叶), 回收率为101.26%.

参照Xue等^{[ 26]}的方法进行了调整, 采用不同的萃取剂依次提取：80%乙醇提取无机态Cd; 去离子水提取水溶态Cd; 其余为残渣态Cd.称取植物样品粉末0.2 g于离心管中, 加入20 mL(样品与萃取剂比值为1∶100, 质量∶体积比)80%乙醇, 匀浆, 室温下振荡22 h, 5 000 r·min^-1离心10 min后收集上清液至聚四氟乙烯消解管, 重复上述操作两次, 按照相同比例加入去离子水, 重复上述萃取操作, 将收集到的萃取液及样品残渣分别于70℃电热板上蒸发至恒重, 按1.4节的方法测定Cd含量.

利用Microsoft Excel 2007进行相关数据的计算、统计及处理.利用SPSS 17.0软件进行统计分析, 新复极差法(Ducan's)进行多重比较、差异显著性检验.利用Origin 2019作图.

经测定, 水稻籽粒中Cd含量结果如 图 2所示, 田间试验的稻田为中轻度Cd污染土壤, 空白对照喷施组中籽粒Cd含量为0.435 mg·kg^-1, 超出我国食品安全国家标准.叶面喷施L-Cys能够显著降低水稻籽粒Cd积累量, 且其降Cd效果随着L-Cys喷施浓度的增加而提高, 呈现浓度依赖性趋势.与空白对照相比, 当喷施浓度为0.5 mmol·L^-1时, 籽粒中Cd含量下降30.6%, 当喷施浓度为5 mmol·L^-1时, 籽粒中Cd含量下降44.5%, 当喷施浓度为10 mmol·L^-1时, 籽粒中Cd含量下降至0.2 mg·kg^-1以下, 降幅高达59.2%, 符合我国食品安全标准.

图 2

Fig. 2

不同小写字母表示处理间差异达到5%显著水平(n=4), 下同 图 2 喷施L-Cys对水稻籽粒中Cd含量的影响 Fig. 2 Effects of foliar application of L-Cys on Cd concentration in rice grains

为了评价叶面喷施L-Cys对稻米品质的影响, 检测水稻籽粒中矿质元素Mg、K、Ca、Mn和Zn的含量变化发现, 水稻开花期叶面喷施一次L-Cys对水稻籽粒中的矿质元素积累没有抑制作用.如 图 3所示, 水稻籽粒中矿质元素含量差异很大, 其中K含量最高, Mg含量其次, 且远高于Ca、Mn和Zn含量.在水稻开花期, 叶面喷施0.5 mmol·L^-1 L-Cys对籽粒中各矿质元素含量的影响最大.与对照相比, 叶面喷施0.5 mmol·L^-1 L-Cys对Mg、K和Mn含量都有显著性提高, 含量分别增长28.4%、22.2%和10.6%; 对Ca和Zn含量无明显影响.喷施5 mmol·L^-1 L-Cys时, Mg和K含量分别增长14.1%和21.0%, 对Ca、Mn和Zn含量无显著影响; 喷施10 mmol·L^-1 L-Cys时, Mg和K含量显著提高, 分别增长19.8%和20.9%, Ca、Mn和Zn含量无显著性差异.

图 3

Fig. 3

图 3 水稻籽粒中矿质元素含量 Fig. 3 Mineral element concentrations in rice grains

由 图 4可见, 水稻各营养器官对Cd的富集能力有很大差异, 顶端第一节Cd积累浓度最高, 可达7.276 mg·kg^-1; 其次是根Cd积累浓度可达6.185 mg·kg^-1; 其余部位Cd积累浓度由高到低依次是顶端第二节＞基部茎叶＞第二节间＞穗颈＞旗叶＞穗轴＞第二叶.其中, 顶端第一节Cd含量可达第二叶Cd含量的7倍, 是相邻营养器官Cd含量的2~5倍, 由此可见, 第一节是水稻拦截Cd的重要营养器官.与空白对照组相比, 叶面喷施L-Cys能够降低水稻各营养器官中的Cd含量, 且其降Cd效果呈现浓度依赖性趋势.当喷施浓度为0.5 mmol·L^-1时, L-Cys显著降低了水稻穗轴、旗叶、穗颈、第二叶、第一节、第二节和第二节间的Cd含量, 但是基部茎叶和根的Cd含量变化不显著.随着L-Cys喷施浓度的增加, 水稻各器官Cd含量呈下降趋势.当喷施浓度为5 mmol·L^-1时, 与空白对照相比, 基部茎叶Cd含量也显著性降低.当喷施浓度为10 mmol·L^-1时, 水稻各器官Cd含量均显著下降, 水稻中穗轴、第一节、穗颈、旗叶、第二节间、第二节、第二叶、基部茎叶和根中Cd含量降幅分别为58.3%、56.0%、62.7%、67.0%、59.3%、61.5%、60.2%、54.9%和50.3%.综上, 叶面喷施L-Cys能够有效抑制水稻各部位营养器官中的Cd积累, 进而影响可食用部位籽粒中的Cd含量.

图 4

Fig. 4

图 4 喷施L-Cys对水稻各器官中Cd含量的影响 Fig. 4 Effects of foliar application of L-Cys on Cd concentration in rice organs

为了进一步探究叶面喷施L-Cys的降Cd作用机制, 本研究对Cd在水稻各营养器官间的转运进行研究( 图 5).水稻不同部位的Cd积累浓度分布反映其迁移能力, 一般用转移因子(transfer factor, TF)来表示:

图 5

Fig. 5

图 5 喷施L-Cys对水稻各器官转移因子的影响 Fig. 5 Effects of L-Cys application on TF in rice organs

图 5显示了不同浓度L-Cys喷施后各器官Cd转移因子变化.在空白对照组中, Cd从第二叶向第二节的转运能力最强, 其次是Cd从旗叶向第一节的转运, 说明在水稻各营养器官中, 节对Cd转运的拦截起到关键作用.由 图 5可见, 与空白对照组相比, 叶面喷施L-Cys对Cd在第一节的转运有显著影响, 转移因子TF_{第一节/旗叶}和TF_{第一节/第二节间}均显著提高, 而TF_{穗颈/第一节}则显著降低.当L-Cys喷施浓度为0.5 mmol·L^-1时, TF_{第一节/旗叶}可增长105.4%, 即Cd从旗叶向第一节的转运率成倍增长; TF_{第一节/第二节间}增长幅度则达45.8%, 即Cd从第二节间向第一节的转运率也增长了近一半; 而同时TF_{穗颈/第一节}则显著下降, 降幅达27.5%, 即Cd从第一节向上到穗颈的转运率降低了近四分之一.喷施浓度为5 mmol·L^-1时, L-Cys对水稻第一节Cd转运的调控与0.5 mmol·L^-1时相近; 而当喷施浓度达到10 mmol·L^-1时, L-Cys仅显著降低了转移因子TF_{第一节/旗叶}, 而对TF_{第一节/第二节间}和TF_{穗颈/第一节}的影响不具有显著性.由此可见, 叶面喷施适当浓度的L-Cys可以促进Cd从旗叶和第二节间向第一节的转运, 同时抑制了Cd从第一节继续向上到穗颈部分转运, 从而提高了第一节对Cd的拦截能力.

为了深入探索叶面喷施L-Cys对水稻Cd拦截关键器官第一节的作用机制, 对第一节中Cd的赋存形态进行检测分析.如 图 6所示, 喷施不同浓度的L-Cys显著降低了水稻第一节中水溶态Cd、无机态Cd和残渣态Cd的含量, 且降Cd幅度随喷施浓度的升高而升高.当喷施浓度达到10 mmol·L^-1时, 水溶态Cd、无机态Cd和残渣态Cd的含量分别降低了77.5%、75.0%和66.0%.通过分析Cd的赋存形态比例发现, 水稻第一节中的Cd主要以残渣态形式存在, 其含量高达89%, 远高于可移动态Cd的比例(无机态Cd比例4.1%, 水溶态Cd比例6.9%), 残渣态Cd含量约为可移动态Cd含量的8倍左右.当喷施浓度为0.5 mmol·L^-1时, 水稻第一节中残渣态Cd比例提高至91.5%, 是可溶态Cd比例的11倍左右.当喷施浓度为5 mmol·L^-1时, 对第一节中Cd形态影响最大, 残渣态Cd比例提高至94.4%, 高达水溶态Cd比例的17倍左右.当喷施浓度为10 mmol·L^-1时, 残渣态Cd比例也提高到92.2%.由此可见, 叶面喷施L-Cys能够同时降低第一节中水溶态Cd、无机态Cd和残渣态Cd的含量, 并改变第一节中Cd的赋存形态, 促进可移动态Cd向残渣态Cd的转化, 提高其中残渣态Cd的比例, 也就是说, 提高了水稻第一节对Cd的固定拦截作用.

图 6

Fig. 6

图 6 喷施不同浓度L-Cys后水稻第一节中不同化学形态Cd的含量和所占比例 Fig. 6 Concentration and proportion of Cd with different chemical forms in rice first node under L-Cys application

L-Cys是一种生物体内常见的氨基酸, 具有提高植物抗氧化活性^{[ 27]}和延缓衰老^{[ 28]}等作用, 具有较好的安全性, 是组成谷胱甘肽的天然成分之一, 分子中含有活泼的巯基, 能够与金属离子形成硫醇盐, 作为解毒类药物使用^{[ 15, 29]}.叶面喷施L-Cys能够影响植物对重金属的耐受性和积累量, 有研究表明, 喷施L-Cys可提高小麦幼苗对铜胁迫的耐受性, 增加小麦叶片和根系中的铜积累量^{[ 22]}, 而本研究发现喷施L-Cys显著抑制了水稻各器官中的Cd积累, 由此可见, 叶面喷施L-Cys对不同植物中不同重金属的吸收积累可能发挥不同的作用, 因此研究L-Cys的作用机制对于指导其应用具有十分重要的意义.目前L-Cys制备工艺相对成熟, 成本低廉, 产率高, 已广泛应用于农业及食品工业等.因此, 将L-Cys作为叶面调理剂的主要成分, 应用于Cd污染水稻修复具有较好的安全性和前景.本研究发现, 水稻开花期叶面喷施一次L-Cys, 就能够显著降低籽粒Cd积累量, 操作方便简单.喷施L-Cys对水稻的降Cd效果随着喷施浓度的增加而提高, 在适当L-Cys浓度作用下, 能够降低稻米Cd含量至我国食品安全标准0.2 mg·kg^-1范围以内, 从而保障稻米安全生产.同时, 喷施L-Cys不会对水稻籽粒中矿质营养元素的积累产生不利影响, 为稻米的营养品质提供了保障.矿质元素, 特别是阳离子矿质元素, 不仅对植物的生长发育起着重要的作用, 同时也影响着水稻中Cd的转运^{[ 14, 30~ 32]}.水稻开花期叶面喷施适当浓度的L-Cys能够提高籽粒中矿质元素Mg、K和Mn的含量.有同位素研究表明, 水稻细胞能够辨识必需元素和有害元素, 并优先转运生长所必需的营养元素^{[ 33]}, 而有害元素Cd主要通过“蹭车”的方式伴随着必需元素进行跨膜运输^{[ 34]}.水稻细胞利用离子泵和离子通道等膜蛋白转运各种元素, 不同膜蛋白对于不同离子的选择性不同, 目前还没有发现Cd转运的专属蛋白, 但是已经证明了锌/铁转运蛋白家族、自然抗性巨嗜细胞蛋白、主要易化子超家族和非选择性阳离子通道NSCCs等膜蛋白, 与Cd的转运密切相关^{[ 32, 35, 36]}, 因此, 阳离子矿质元素的增加很可能竞争性地抑制Cd转运, 从而降低水稻籽粒中Cd积累.

在长期的自然进化过程中, 水稻的根茎叶等营养器官能够把大量的Cd固定在细胞壁中, 或封存在液泡中, 经过层层拦截, 最终只有极少数的Cd转运进入到籽粒中.在此过程中, 叶片中的Cd也可以通过茎中的韧皮部转运到籽粒中^{[ 37]}, 有研究表明^{[ 12~ 14]}, 喷施降Cd叶面调理剂通过提高叶片等营养器官对Cd的固定作用, 抑制茎叶中可移动态Cd的转运, 进而降低籽粒中的Cd含量.因此, 叶面喷施L-Cys能够直接作用于叶片, 调控Cd向籽粒中的转运.本研究发现, 叶面喷施L-Cys不但能够抑制籽粒Cd积累, 对水稻各营养器官的Cd转运积累也有调控作用, 能够显著降低水稻各营养器官中的Cd含量, 其降Cd效果随喷施浓度的增加而提高.其中, 水稻的第一节富集了高浓度的Cd, 约是第二节间和穗颈Cd浓度的2~4倍, 在水稻营养器官拦截Cd转运进入籽粒中起到重要作用, 而叶面喷施适当浓度的L-Cys可以促进Cd从旗叶和第二节间向第一节的转运积累, 同时抑制Cd从第一节继续向上到穗颈部分积累, 从而提高了第一节对Cd的拦截能力.水稻节组织中的厚壁细胞充满原生质, 细胞壁很厚, 叶、分蘖及根的输导组织都在茎节内会合, 很有可能与Cd的固定相关.其他研究也证明了本文的推测, 在高污染环境中, 第一节中的Cd浓度可高达40 mg·kg^{-1[ 30]}, 扫描电镜检测结果显示, 水稻中Cd主要分布在节和节间维管束组织的细胞壁上^{[ 38]}, 而水稻开花期第一节中表达水平显著提高的OsLCT1基因, 可以有效降低稻米Cd含量^{[ 39]}.Feng等^{[ 37]}的研究显示, 根和节是阻碍Cd进入籽粒的两个关键障碍, 顶端第一节Cd隔离能力最强, 且具有高基因表达参与糖酵解和Cd解毒, 顶端第一节对抑制Cd向籽粒转运发挥重要作用^{[ 34, 40]}.由此可见, 第一节是水稻营养体拦截Cd转运的关键器官, 而叶面喷施L-Cys不但能够降低水稻各营养器官的Cd积累量, 同时还能够调控关键器官第一节的作用, 提高第一节对Cd的拦截能力, 进而有效地抑制营养体中Cd向籽粒的转运.

为了深入探究叶面喷施L-Cys影响水稻第一节Cd积累转运的作用机制, 对第一节中Cd的赋存形态进行了分析.重金属的生物有效性与其存在形态密切相关, 反映了其对环境动植物以及人类的毒性危害, 而改变重金属在环境和生物体内的化学形态, 可以有效降低有害元素的生物有效性及其在可食用部位积累量^{[ 29]}.在水稻体内, Cd赋存形态的变化与其可移动性密切相关, 是Cd转运积累的重要影响因素.叶面喷施L-Cys能够同时降低第一节中水溶态Cd、无机态Cd和残渣态Cd的含量, 并改变第一节中Cd的赋存形态, 提高其中残渣态Cd的比例, 促进顶端第一节中活跃的可移动态Cd(水溶态Cd和无机态Cd)转化为稳定的残渣态Cd, 提高水稻第一节对Cd的固定能力.由此可见, 在水稻开花期叶面喷施L-Cys, 不但能够降低水稻各器官的Cd积累量, 还能够调控Cd拦截能力最强的营养器官第一节对Cd的固定作用, 促进相邻营养器官将Cd转运到第一节中, 并降低第一节中Cd的可移动性, 将Cd固定在第一节中, 进而抑制Cd向穗颈的转运, 最终降低籽粒Cd积累.综上所述, 在水稻开花期叶面喷施L-Cys, 能够通过降低营养器官Cd积累量和提高第一节对Cd转运的拦截能力这两种途径, 抑制水稻籽粒Cd积累, 因此, 将L-Cys作为水稻降Cd叶面调理剂的主要成分, 应用于污染农田稻米安全生产, 具有较好的前景.

(1) 在水稻开花期叶面喷施一次L-Cys可以显著降低籽粒中Cd含量, 且其降Cd效果随喷施浓度增大而提高, 同时不抑制籽粒中矿质元素Mg、K、Mn、Ca和Zn的积累.

(2) 叶面喷施L-Cys显著降低了水稻各营养器官中Cd含量, 同时促进了Cd从旗叶和第二节间向向第一节的积累, 抑制了Cd从第一节向穗颈的积累, 进而提高了水稻第一节对Cd转运的拦截作用.

(3) 叶面喷施L-Cys能够同时降低水稻第一节中无机态、水溶态和残渣态Cd的含量, 并提高其中残渣态Cd的比例, 从而提高第一节对Cd的结合和固定, 抑制可移动Cd向籽粒的转运.

(4) L-Cys作为一种水稻降Cd叶面调理剂的主要成分, 具有较好的应用前景.